在此次新冠病毒疫情的發(fā)現(xiàn)和防控當(dāng)中，包括基因測(cè)序、RT-PCR在內(nèi)的病原檢測(cè)技術(shù)做出了有目共睹的貢獻(xiàn)，也接受了前所未有的壓力和挑戰(zhàn)。這篇文章總結(jié)了病原核酸檢測(cè)在此次疫情中發(fā)揮的作用，以及個(gè)人對(duì)病原測(cè)序行業(yè)未來(lái)的一些思考。

1、新冠病毒的發(fā)現(xiàn)

毋庸置疑，基因測(cè)序技術(shù)在此次新冠病毒的發(fā)現(xiàn)中起了非常關(guān)鍵的作用。

首先，復(fù)旦大學(xué)張永振團(tuán)隊(duì)從一位病人的肺泡灌洗液樣本中提取病毒，通過二代測(cè)序準(zhǔn)確地測(cè)定了病毒的基因序列，上傳到GenBank，并指出了它和SARS病毒的相似度（Wu et al, “A new coronavirus associated with human respiratory disease in China”）。

接著，中科院武漢病毒所石正麗團(tuán)隊(duì)通過對(duì)5個(gè)病人樣本的測(cè)序判定病毒和來(lái)自蝙蝠的BatCoV RaTG13病毒序列更為相近，但和SARS病毒有同樣的ACE2 cell entry receptor。同一團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出了正確的qPCR檢測(cè)方法（Zhou et al, “Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin”）。這為迅速判定疫情和對(duì)病人確診打下了基礎(chǔ)。

此后，中國(guó)疾控中心譚文杰團(tuán)隊(duì)使用三種測(cè)序方法（Lu et al, “Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding”)分析了病毒的變異位點(diǎn)和進(jìn)化樹。

至此，我國(guó)科研單位在差不多一個(gè)月之內(nèi)迅速發(fā)現(xiàn)了正確的致病病毒并完成測(cè)序，和全世界分享了病毒的序列和已知變異，給出了有效的核酸檢驗(yàn)方法。這些工作都得到了各國(guó)政府和世界衛(wèi)生組織WHO的高度評(píng)價(jià)。

Mapped read count plot showing the coverage depth per base of the WHCV genome

(Wu et al, 'A new coronavirus associated with human respiratory disease in China')

在這些發(fā)現(xiàn)新冠病毒的工作中發(fā)揮出色的是mNGS（metagenomics next generation sequencing，宏基因組測(cè)序）技術(shù)。發(fā)現(xiàn)新病原的關(guān)鍵在于高通量和準(zhǔn)確率。因?yàn)樾虏≡跇颖局械呢S度和序列未知，因此為從大量的背景核酸中判定新病毒數(shù)據(jù)，必須要有足夠的reads數(shù)來(lái)支持生信分析。

從復(fù)旦張永振團(tuán)隊(duì)的文章可以看出，為了拿到未知病毒120K準(zhǔn)確的Reads，整個(gè)metagenomics測(cè)序通量達(dá)到了50M以上(多余DNA序列來(lái)自人和其它微生物)。從前面的圖示還可以看到病毒測(cè)序的覆蓋率不均勻，這個(gè)現(xiàn)象很可能和逆轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增偏好有關(guān)，這無(wú)疑更加提升了數(shù)據(jù)量要求和序列組裝的難度。高準(zhǔn)確率的重要性對(duì)de novo測(cè)序毋需多言。在沒有準(zhǔn)確reference提供比對(duì)依據(jù)的時(shí)候，原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率對(duì)組裝至關(guān)重要。二代測(cè)序優(yōu)秀的通量和準(zhǔn)確率在此得到充分的體現(xiàn)。

對(duì)于三代測(cè)序或單分子測(cè)序而言，其優(yōu)勢(shì)在于通過減少擴(kuò)增來(lái)達(dá)到更均勻的基因組覆蓋和更真實(shí)的病原豐度排序。病人樣品里的病毒RNA豐度非常有限，而且RNA在樣本儲(chǔ)存，提取和逆轉(zhuǎn)錄過程中會(huì)進(jìn)一步損失。因此現(xiàn)在所有的mNGS測(cè)序方法都必須經(jīng)過兩次擴(kuò)增：第一步是cDNA文庫(kù)PCR， 第二步是測(cè)序前的RPA/RCA擴(kuò)增或橋式PCR。病原單分子測(cè)序工作只需要文庫(kù)制備后的擴(kuò)增，對(duì)cDNA的擴(kuò)增也必須優(yōu)化以盡量減少偏好性。國(guó)內(nèi)的科研機(jī)構(gòu)和科技企業(yè)已經(jīng)在積極開發(fā)針對(duì)新冠病毒測(cè)序的三代測(cè)序方案，其中包括中國(guó)疾控中心的Nanopore測(cè)序方案，真邁生物基于GenoCare測(cè)序儀的單分子測(cè)序試劑盒，以及貝瑞基因基于PacBio Sequel-II測(cè)序儀的單分子測(cè)序試劑盒。

值得一提的是，單分子直接RNA測(cè)序在未來(lái)是一個(gè)很有潛力的病原測(cè)序途徑?，F(xiàn)在它的準(zhǔn)確率和讀長(zhǎng)仍和cDNA測(cè)序有一定距離，但是這一方法可以直接測(cè)量病毒RNA堿基的修飾（Viehweger et al, “Direct RNA nanopore sequencing of full-length coronavirus genomes provides novel insights into structural variants and enables modification analysis”）。我們期待在這個(gè)方向上有更多的成果來(lái)闡明RNA修飾在病毒中的作用。

2、新冠病毒的核酸檢測(cè)

新冠病毒的主流核酸檢測(cè)方法無(wú)疑是熒光定量PCR，但這里我不贅述PCR的技術(shù)細(xì)節(jié)。最近大家意見比較多的一個(gè)問題就是熒光PCR的假陰性率高，然后是操作時(shí)間過長(zhǎng)，最后是對(duì)于不同樣品的敏感度。這幾個(gè)問題跟癌癥早篩面臨的問題相似。假陰性和操作時(shí)間其實(shí)是互相矛盾的。速度越快，擴(kuò)增效率越低，陽(yáng)性率會(huì)越差。平心而論，熒光PCR的使用還是非常成功的。

核酸檢測(cè)的假陰性問題雖然要盡量解決，但分子診斷中由于檢測(cè)限和樣品質(zhì)量問題出現(xiàn)假陰很難避免。導(dǎo)致檢測(cè)錯(cuò)誤出現(xiàn)的因素是多方面的，網(wǎng)絡(luò)上已有專業(yè)人士對(duì)此進(jìn)行充分的技術(shù)普及，這里我只想說(shuō)一下病人樣品種類這一點(diǎn)。最近深圳市第三人民醫(yī)院的研究顯示，痰液樣品的陽(yáng)性率大大超過咽拭子這樣的固體樣品（Yang et al, ”Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCoV infection”）。 在核酸檢測(cè)方法上，進(jìn)一步優(yōu)化樣品采集方式可能是最值得做的工作。

其它檢測(cè)方法中，等溫?cái)U(kuò)增和免疫檢測(cè)雖然更快，但特異性和檢測(cè)限相比于熒光PCR沒有優(yōu)勢(shì)；CT檢查則難以做到規(guī)模化的廣泛使用。

這次疫情對(duì)中國(guó)的體外診斷行業(yè)是一個(gè)巨大的考驗(yàn)。為了幫助醫(yī)院盡快診斷，做好診斷，上百家企業(yè)在春節(jié)期間加班加點(diǎn)趕制檢測(cè)試劑盒和儀器。這種“飽和式救援“保證了節(jié)后的試劑盒供應(yīng)充足，也把整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈推到了極限。我們應(yīng)當(dāng)對(duì)中國(guó)IVD行業(yè)整體的快速響應(yīng)和努力付出感到自豪，同時(shí)也期待在以下方面能有更大的提升：

1）核心原料的產(chǎn)能和質(zhì)量還要進(jìn)一步提高。

大部分的IVD公司都只有設(shè)計(jì)試劑盒的能力，而沒有提供試劑原料的能力。這些原料的產(chǎn)量和質(zhì)量對(duì)檢測(cè)試劑盒的性能是至關(guān)重要的，國(guó)內(nèi)的原料供應(yīng)鏈企業(yè)在此次疫情中也暴露出了極限生產(chǎn)時(shí)的速度和供貨困難。如果一些IVD企業(yè)在擁有檢測(cè)方法的同時(shí)也具備核心原料的自主制備能力或產(chǎn)業(yè)鏈布局，可以期待它們能夠更從容地應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情，在趕進(jìn)度的同時(shí)保障試劑的供應(yīng)和質(zhì)量。

2）快速檢測(cè)的技術(shù)儲(chǔ)備需要加強(qiáng)。

快速檢測(cè)雖然不一定最準(zhǔn)確，但是它對(duì)于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)確實(shí)是有價(jià)值的?，F(xiàn)在這些快速檢測(cè)產(chǎn)品的供應(yīng)商大部分都還是比較年輕的公司，在當(dāng)前的競(jìng)爭(zhēng)中相比于PCR企業(yè)處于劣勢(shì)。但是幾年之后，他們可能就會(huì)像行業(yè)的前輩們一樣積攢足夠的商譽(yù)，像等溫?cái)U(kuò)增試劑檢測(cè)盒這樣的產(chǎn)品會(huì)得到更多的應(yīng)用?，F(xiàn)在幾種主流的核酸快檢方法，如RPA、SHERLOCK和LOOP，都是試劑比較復(fù)雜的體系。國(guó)內(nèi)的廠商大多需要自己做試劑和儀器，而不是像PCR行業(yè)一樣有比較可靠的產(chǎn)業(yè)鏈提供試劑，有通用的PCR儀可以借助。可以預(yù)見，下一步核酸快檢會(huì)得到更多的支持，類似于PCR的產(chǎn)業(yè)鏈和通用儀器會(huì)形成，下一次傳染病危機(jī)中快檢產(chǎn)品的開發(fā)速度和質(zhì)量都會(huì)提高。

3、新冠之后的病原測(cè)序

如上所述，測(cè)序?qū)τ诓《镜陌l(fā)現(xiàn)和研究（包括分類，溯源，蛋白研究，疫苗開發(fā)）非常重要，但是在診斷中就沒有大量用到測(cè)序。第一，畢竟測(cè)序太貴；第二，測(cè)序需要的樣本量高；第三，測(cè)序需要的時(shí)間相對(duì)更長(zhǎng)。那么這次疫情之后測(cè)序儀在醫(yī)院的應(yīng)用會(huì)不會(huì)加速？可以預(yù)期，具備測(cè)序儀制造能力的企業(yè)都會(huì)推動(dòng)其產(chǎn)品在病原測(cè)序方向的報(bào)證，測(cè)序儀在醫(yī)院的投放會(huì)增加，但也可以預(yù)計(jì)，只有科研能力強(qiáng)的醫(yī)院會(huì)真正做病原變異和微生物宏基因組方面的工作。大部分三甲醫(yī)院主要還是用更加簡(jiǎn)便和快速的核酸檢測(cè)方法測(cè)已知病原，它們可能會(huì)更多的把力量花在qPCR能力、快速檢測(cè)設(shè)備以及生物安全防護(hù)能力的提升上。而對(duì)于未知病原的測(cè)序，將更多的還是由CDC和中科院病毒所這樣的機(jī)構(gòu)去實(shí)施。

那么第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)會(huì)不會(huì)購(gòu)買更多的測(cè)序儀呢? 很有可能。以后可能會(huì)形成醫(yī)院做常見病原的PCR檢測(cè)、第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)做疑難感染病原測(cè)序的分工。第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的測(cè)序一定要能夠給出一個(gè)廣譜的病原鑒定結(jié)果。所以相應(yīng)病原測(cè)序產(chǎn)品的通量要高，病原數(shù)據(jù)庫(kù)要大。至于它是否有醫(yī)療器械證反而不一定很重要。廣譜病原檢測(cè)的醫(yī)療器械證用什么標(biāo)準(zhǔn)審批也是一個(gè)問題。國(guó)家藥監(jiān)局需要制定新的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)盤。

此次疫情以后，國(guó)家必定會(huì)采取一些措施防止疫情重現(xiàn)，提升抗疫能力。其中和測(cè)序相關(guān)的一些可能的舉措有：

?1）長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)傳染病高發(fā)地點(diǎn)的病原分布，提前預(yù)警

這包括海鮮市場(chǎng)，肉類批發(fā)市場(chǎng)，人群聚集場(chǎng)所這些地點(diǎn)。疾控部門的檢測(cè)會(huì)突破現(xiàn)有的已知病原范疇，進(jìn)入未知病原的預(yù)警和疫苗目標(biāo)的預(yù)判工作。樣品可能會(huì)交由第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行測(cè)序。

2）追蹤病毒變異

歷史上強(qiáng)傳染性病原變異重現(xiàn)非常普遍。如2009H1N1流感病毒在美國(guó)爆發(fā)，變異后擴(kuò)展到全球，一直到現(xiàn)在還會(huì)傳播 （Ref：https://www.cdc.gov/flu/pandemic-resources/2009-h1n1-pandemic.html）。哪怕是比較小的變異也可能會(huì)對(duì)病毒的傳染性造成很大影響（Maurer-Stroh et al, “A new common mutation in the hemagglutinin of the 2009 (H1N1) influenza A virus”），因此疾控部門的病原測(cè)序會(huì)成為長(zhǎng)期的工作。

3）加強(qiáng)儲(chǔ)備針對(duì)冠狀病毒的藥物和疫苗技術(shù)

冠狀病毒給中國(guó)帶來(lái)了SARS和COVID-19兩次大規(guī)模的疫情，這表明我國(guó)人群對(duì)冠狀病毒可能有一定的易感性。因此，即使是在此次新冠疫情結(jié)束之后，也需要持續(xù)開展針對(duì)冠狀病毒的藥物開發(fā)，尤其要對(duì)一些現(xiàn)有藥物做進(jìn)一步的測(cè)試和評(píng)估，把它們推過安全性驗(yàn)證階段，可能成為未來(lái)抗疫立刻可用的武器。

在預(yù)防方面，針對(duì)冠狀病毒的廣譜疫苗的開發(fā)勢(shì)在必行，開發(fā)中必須繞開高頻變異位點(diǎn)，兼顧相似病毒。

4）監(jiān)測(cè)醫(yī)院病原環(huán)境，控制院內(nèi)交叉感染

高達(dá)40%的院內(nèi)傳染率（Wang et al, “Clinical Characteristics of 138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus–Infected Pneumonia in Wuhan, China”）是造成這次疫情擴(kuò)大的一大原因。歷史上病毒/細(xì)菌交叉感染也是重癥的一大來(lái)源，對(duì)醫(yī)院、社區(qū)診所的定時(shí)病原監(jiān)測(cè)很有意義。

不過這不會(huì)是一件容易的事。可以想象，由于醫(yī)院氣溶膠環(huán)境的復(fù)雜性，測(cè)序檢出的結(jié)果將是一個(gè)很長(zhǎng)的微生物清單，如何從中得到有效的解讀將是一個(gè)不小的挑戰(zhàn)。但我仍然認(rèn)為值得去做。我們現(xiàn)在所熟悉的PM2.5指數(shù)也不是從來(lái)就有，但關(guān)注的人多了就會(huì)天天測(cè)，而且成為污染治理的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。微生物測(cè)序也可以提供一個(gè)類似的引導(dǎo)。此外，如果能開發(fā)出一種能夠直接從空氣中取氣溶膠病原樣品測(cè)序的儀器，將會(huì)非常有價(jià)值。

以上僅是我對(duì)病原測(cè)序行業(yè)未來(lái)發(fā)展的一些個(gè)人思考。作為一名在基因行業(yè)里超過20年的從業(yè)者，我想說(shuō)的是，雖然此次新冠抗疫之戰(zhàn)使得基因檢測(cè)技術(shù)成為大眾矚目的焦點(diǎn)，但最好的技術(shù)并不是用來(lái)贏得戰(zhàn)“疫”，而是用來(lái)防止戰(zhàn)“疫”的出現(xiàn)。這才是我們投身于基因科技的初衷。

孫雷，CTO，真邁生物（GeneMind Biosciences）。1993年畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)材料系，在美國(guó)硅谷具有二十年以上的基因行業(yè)經(jīng)歷。曾任美國(guó)太平洋生物（Pacific Biosciences）主任科學(xué)家兼高級(jí)總監(jiān)，Intel研究院Nanoparticle項(xiàng)目主任，GE Healthcare資深科學(xué)家。