近日，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院王金凱教授課題組在Molecular Cell（IF 14.5）上發(fā)表了題為“Single-molecule m⁶A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms”的研究成果。研究團(tuán)隊開發(fā)了一種名為m6Aiso的深度學(xué)習(xí)模型，在牛津納米孔直接RNA測序的單個讀長上檢測m⁶A修飾。訓(xùn)練該深度學(xué)習(xí)模型是基于內(nèi)源性標(biāo)記產(chǎn)生的上百萬個單分子m⁶A陽性電信號。該研究揭示了：1、不同m⁶A位點在單分子上存在距離依賴的連鎖；2、相同的m⁶A位點在不同的異構(gòu)體上也能夠通過三種不同的機(jī)制產(chǎn)生廣泛的差異；3、轉(zhuǎn)錄因子SMAD3在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中調(diào)控m⁶A選擇性地上調(diào)使用的SMAD3結(jié)合的啟動子的異構(gòu)體的m⁶A，形成異構(gòu)體特異的m⁶A調(diào)控。m6Aiso技術(shù)為研究m⁶A修飾的復(fù)雜性和動態(tài)變化提供了新的工具，為理解m⁶A在異構(gòu)體上的復(fù)雜性提供了新的視角。

m⁶A是mRNA和多種非編碼RNA上一種普遍且動態(tài)的修飾。而越來越多的研究表明m⁶A修飾與RNA異構(gòu)體的生成和代謝密切相關(guān)。那么不同的RNA異構(gòu)體上的相同m⁶A位點是否也能夠產(chǎn)生差異的m⁶A修飾？盡管GLORI和eTAM-seq等技術(shù)能夠以單核苷酸分辨率準(zhǔn)確識別和定量m⁶A，但目前缺乏能夠在單個完整RNA分子上準(zhǔn)確識別m⁶A的方法，因此難以區(qū)分不同異構(gòu)體上的m⁶A。而納米孔直接RNA測序（ONT?DRS）技術(shù)可以通過檢測全長RNA通過納米孔時的電流變化來檢測m⁶A修飾，有望能解析RNA異構(gòu)體的復(fù)雜性。由于納米孔一次性讀取多個堿基的電信號，缺乏高質(zhì)量的單分子m⁶A修飾信號，訓(xùn)練能夠準(zhǔn)確識別單個DRS讀取的模型仍是一個挑戰(zhàn)。

研究者利用DART-seq技術(shù)，通過APOBEC1-YTH融合蛋白在活細(xì)胞中誘導(dǎo)m⁶A位點附近的C-to-U突變，以實現(xiàn)單核苷酸分辨率的m⁶A識別。研究發(fā)現(xiàn)，這些C-to-U突變并非集中于m⁶A鄰近位置，而傾向于在距離m⁶A位點100 nt范圍內(nèi)聚集成簇。那么這些距離在10100nt范圍內(nèi)的突變能夠用于標(biāo)記m⁶A位點，而不會干擾ONT DRS中m⁶A甲基化5-mer的電流信號。基于這種內(nèi)源性標(biāo)記策略，研究團(tuán)隊利用在ONT DRS數(shù)據(jù)中提取了1,020,237個讀長水平的5-mer?m⁶A信號，并結(jié)合深度殘差神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，成功開發(fā)了能夠在單條讀長水平上識別m⁶A的工具m6Aiso。此外，研究者還采用了真邁生物的SURFSeq 5000平臺完成了A549細(xì)胞系的GLORI測序，為m6Aiso 在多個細(xì)胞系中的準(zhǔn)確性評估提供了有力的支撐，同時也反映了SURFSeq 5000平臺進(jìn)行二代高通量測序具有高度的可靠性。如下圖所示,研究團(tuán)隊在多個細(xì)胞系中比較了m6Aiso以及GLORI測序得到的m⁶A修飾水平，m6Aiso在HEK293T, HeLa, A549, mESC中都和GLORI高度一致，其中HEK293T, HeLa和 mESC的GLORI數(shù)據(jù)來源于原始的GLORI論文，而A549細(xì)胞的GLORI數(shù)據(jù)為團(tuán)隊自行建庫后采用SURFSeq 5000平臺完成的測序。

圖1 不同細(xì)胞系m6Aiso和GLORI測序得到的m⁶A修飾水平比較

利用工具m6Aiso，研究者闡述了相同m⁶A位點不同的異構(gòu)體上形成差異化m⁶A修飾的三種機(jī)制：1、EJC（外顯子連接復(fù)合體）對m⁶A抑制的差異，與之前的研究一致，發(fā)現(xiàn)EJC會抑制靠近外顯子邊界的m⁶A沉積，即在異構(gòu)體中外顯子邊界200 bp范圍內(nèi)的m⁶A甲基化水平較低；2、RNA結(jié)合蛋白對不同異構(gòu)體RNA的特異性結(jié)合，如TARBP2結(jié)合內(nèi)含子的鄰近外顯子上的m⁶A位點的甲基化水平顯著高于未結(jié)合TARBP2內(nèi)含子的鄰近外顯子；3、轉(zhuǎn)錄因子也會調(diào)控m⁶A，主要通過共轉(zhuǎn)錄的方式招募m⁶A 的甲基化轉(zhuǎn)移酶來修飾其轉(zhuǎn)錄的RNA，因此使用不同啟動子的RNA由于轉(zhuǎn)錄因子不同而產(chǎn)生差異的m⁶A修飾。由于變化的m⁶A位點位于共同的3'UTR，而短讀長測序無法確定每個亞型的具體5'區(qū)域，因此這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了在研究m⁶A動態(tài)變化時使用長讀長測序的必要性。

圖2?m⁶A在單reads上的內(nèi)源性標(biāo)記和m6Aiso在單分子水平上的結(jié)果評價

Guo WB?Ren ZJ, Huang X, et al.Single-molecule m⁶A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms[J].Molecular Cell, 2025, 85: 1-14.