中藥資源是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，中藥資源研究方法正逐步形成以分子生物學(xué)、生物信息學(xué)及計(jì)算機(jī)科學(xué)等為主要研究手段的多學(xué)科交叉體系。眾所周知，中藥方劑化學(xué)成分復(fù)雜，難以找到單一作用靶點(diǎn)，闡明可能的藥理，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以對(duì)藥物干預(yù)機(jī)體的分子變化進(jìn)行多維度、多靶點(diǎn)的描繪，以彌補(bǔ)單基因研究的不足，全面揭示藥理機(jī)制，從而為方藥有效成分的篩選、新藥的發(fā)現(xiàn)以及優(yōu)良種質(zhì)資源的培育奠定基礎(chǔ)，為中西醫(yī)結(jié)合治療提供數(shù)據(jù)支撐。

近日，真邁生物的合作單位紹興市婦幼保健院在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》雜志上發(fā)表了題為“Inhibition of Hepatitis B Virus (HBV) replication and antigen expression byBrucea javanica(L.) Merr. oil emulsion”的研究成果。該研究結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及高通量測(cè)序證實(shí)：鴉膽子（Brucea javanica(L.) Merr.）油乳劑（BJOE）對(duì)人乙型肝炎病毒（HBV）的復(fù)制和抗原表達(dá)存在明顯的抑制作用，且這種作用是通過(guò)上調(diào)白細(xì)胞介素6（IL-6）實(shí)現(xiàn)的，揭示了其潛在的抗病毒機(jī)理。基于真邁生物GenoLab M高通量基因測(cè)序平臺(tái)對(duì)BJOE處理前后的肝癌細(xì)胞系HepG2進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，進(jìn)一步確定BJOE對(duì)肝癌細(xì)胞中IL-6基因的影響。本研究為BJOE的HBV臨床治療潛力提供了新的見解，也說(shuō)明對(duì)于真實(shí)樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，GenoLab M表現(xiàn)依然優(yōu)秀，獲得學(xué)術(shù)界的認(rèn)可。

*以下為該研究成果解讀

背景簡(jiǎn)介

乙型肝炎病毒（HBV) 感染是目前全球最主要的健康衛(wèi)生問(wèn)題之一，慢性HBV感染是導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭及肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要原因。據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)：2019年，全球有2.96億人患有慢性乙肝感染，且每年有150萬(wàn)新發(fā)感染者，對(duì)公共安全造成很大威脅。HBV是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，包括三種重要的免疫標(biāo)記物，也是HBV病毒組裝的三個(gè)重要組成成分：HBsAg（乙肝表面抗原），HBeAg（乙肝e抗原），HBcAg（乙肝核心抗原）。目前，抗HBV治療藥物主要有兩類：α干擾素（IFN-α）和核苷類似物NAs（如lamivudine：中文名拉米夫定，簡(jiǎn)稱LMV）。前者通過(guò)直接抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗增殖作用發(fā)揮抗病毒活性；后者通過(guò)模擬生理核苷，靶向HBV逆轉(zhuǎn)錄酶，有效抑制病毒DNA復(fù)制。但是，由于耐藥突變的不斷出現(xiàn)、病毒載量的提高及血清中轉(zhuǎn)氨酶的增加，會(huì)導(dǎo)致抗HBV藥物的療效顯著降低。因此，HBV治療仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。

鴉膽子是盛產(chǎn)于我國(guó)南方的一種中藥材，味苦、性寒、微毒，被報(bào)道對(duì)多種疾病具有良好的治療效果，包括癌癥、瘧疾、痢疾及胃潰瘍等。鴉膽子種子提取的重要成分，具有顯著的抗植物病毒活性。然而，鴉膽子是否能抗HBV，如能，這種抗性的機(jī)制又是怎樣的呢？目前尚無(wú)報(bào)道。本文通過(guò)大量的體外實(shí)驗(yàn)，研究鴉膽子油乳劑對(duì)HBV體外復(fù)制、抗原表達(dá)及細(xì)胞因子分泌的作用，證實(shí)其對(duì)乙型肝炎的臨床治療潛力，并闡明其可能的抗病毒作用機(jī)制。

結(jié)果概要

01?研究框架

本研究使用三種肝癌細(xì)胞系：Huh7，HepG2以及HepG2.2.15（由HepG2改造而來(lái)，可以穩(wěn)定表達(dá)HBV亞復(fù)制子和病毒抗原），Huh7和HepG2體外轉(zhuǎn)染HBV-WT（野生型）或HBV-LMV-MT（抗拉米夫定突變型）復(fù)制子質(zhì)粒以實(shí)現(xiàn)HBV的穩(wěn)定復(fù)制和抗原表達(dá)。使用不同劑量的BJOE處理細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞活性檢測(cè)、qRT-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）、CMIA（化學(xué)發(fā)光微粒子免疫測(cè)定）、Western Blot（蛋白免疫印跡）、FCM（流式細(xì)胞術(shù)）以及RNA-seq（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）等技術(shù)手段，確定BJOE的抗HBV作用機(jī)制。

02?BJOE對(duì)細(xì)胞活力的影響

該研究首先檢測(cè)在不同的劑量濃度和時(shí)間梯度下，BJOE對(duì)肝癌細(xì)胞活力的影響，以確定合適的BJOE使用濃度，用于后續(xù)抗病毒實(shí)驗(yàn)，以避免BJOE對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)）證實(shí)（Figure 1E-G）：BJOE≤5 mg/ml，作用時(shí)間24小時(shí)和48小時(shí)，均不會(huì)造成肝癌細(xì)胞活力的明顯改變，故后續(xù)研究中BJOE使用的最大濃度為5 mg/ml。

隨后，研究人員使用BJOE處理HepG2.215，以及轉(zhuǎn)染HBV-WT的HepG2和Huh7細(xì)胞。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與拉米夫定抑制病毒復(fù)制的結(jié)果類似，BJOE可以有效降低HBV的復(fù)制水平，尤其在5 mg/ml使用濃度時(shí)，約40%的HBV復(fù)制被抑制（Figure 2A-C）。CMIA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg，Western Blot檢測(cè)HBcAg表達(dá)水平，結(jié)果表明：三種乙肝病毒抗原在BJOE處理后，都呈現(xiàn)明顯的下調(diào)，而拉米夫定對(duì)HBV抗原表達(dá)沒有影響（Figure 2D-H）。

通過(guò)FCM檢測(cè)BJOE處理后肝癌細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的水平，發(fā)現(xiàn)BJOE顯著增強(qiáng)HepG2和Huh7細(xì)胞中IL-6的分泌，但在HepG2.215細(xì)胞中，作用并不明顯（Figure 3）。為進(jìn)一步驗(yàn)證BJOE、IL-6和HBV的關(guān)系，對(duì)轉(zhuǎn)染HBV-WT質(zhì)粒的HepG2和Huh7細(xì)胞分別使用BJOE和DMSO（二甲基亞砜）處理，檢測(cè)上清中細(xì)胞因子的水平，結(jié)果表明：DMSO顯著下調(diào)IL-6的水平，與其促進(jìn)病毒復(fù)制的作用一致；而BJOE顯著上調(diào)IL-6的水平，結(jié)合上述BJOE抑制HBV復(fù)制和抗原表達(dá)的結(jié)果，我們推測(cè)BJOE通過(guò)上調(diào)IL-6從而發(fā)揮抗病毒作用（Figure 4A-B）。研究人員為驗(yàn)證上述推測(cè)，對(duì)HBV-WT轉(zhuǎn)染的HepG2和Huh7細(xì)胞，外源加入重組IL-6后，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞中HBV的復(fù)制及抗原表達(dá)均被明顯抑制，說(shuō)明IL-6的上調(diào)可以直接抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，而這種上調(diào)是BJOE刺激引起的（Figure 4C-D）。

為進(jìn)一步探討B(tài)JOE對(duì)肝癌細(xì)胞中IL-6轉(zhuǎn)錄水平的影響，研究人員對(duì)BJOE處理的HepG2細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明：BJOE導(dǎo)致HepG2細(xì)胞中IL-6基因上調(diào)，且IL-6作為關(guān)鍵基因，在細(xì)胞內(nèi)與多種基因存在相互作用。在GO富集通路中，IL-6廣泛參與肝臟相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，包括肝細(xì)胞增殖和形態(tài)發(fā)生，以及肝臟功能實(shí)現(xiàn)（Figure 5）。

HepG2/Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV-WT或HBV-LMV-MT質(zhì)粒后，使用BJOE或拉米夫定處理細(xì)胞，然后通過(guò)qRT-PCR及FCM檢測(cè)HBV的復(fù)制及抗原表達(dá)。結(jié)果表明，5 mg/ml BJOE可以有效抑制WT和LMV-MT的復(fù)制，以及HBV抗原的表達(dá)；而LMV僅對(duì)WT有效，對(duì)突變型無(wú)效。當(dāng)兩者聯(lián)合使用時(shí)，抗病毒效應(yīng)被加強(qiáng)（Figure 6）。

為進(jìn)一步探討鴉膽子單一成分的抗HBV作用，研究人員使用鴉膽子苦醇（brusatol）、鴉膽子堿A（bruceine A）、鴉膽子堿B（bruceine B）、鴉膽亭（bruceantin）和鴉膽子苦味素（bruceantinol）分別處理HepG2和Huh7細(xì)胞后，檢測(cè)上清中細(xì)胞因子的水平，結(jié)果表明：鴉膽子堿B可以上調(diào)IL-6的水平（Figure 7A-B），且在HepG2.215中有效抑制HBV復(fù)制和抗原表達(dá)（Figure 7C）。

基于上述分析，我們得出如下結(jié)論：

1、BJOE可以有效抑制HBV復(fù)制及病毒抗原表達(dá)；

2、BJOE可以調(diào)節(jié)IL6的分泌，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用；

3、BJOE不僅對(duì)WT病毒發(fā)揮有效的抗病毒作用，對(duì)LMV-MT病毒同樣有效；

4、在BJOE抗HBV作用中，其活性成分--鴉膽子堿B發(fā)揮關(guān)鍵作用。