近日，湖州學院生命科學學院浙江省水產資源保護與開發(fā)重點實驗室在?（Aquaculture?IF 4.5）發(fā)表題為“Changes in molting frequency and expression patterns of molting-related genes in?Macrobrachium?rosenbergii?with exogenous calcium supplement in water?”的研究成果。為研究外源補鈣對羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)脫皮的影響，該研究采用25 mg/L、85 mg/L、145 mg/L和205 mg/L梯度鈣濃度的水對羅氏沼蝦進行培養(yǎng)試驗。結果表明，145 mg/L濃度組的累積脫皮率最高。145 mg/L濃度組在脫皮前和脫皮后均表現(xiàn)出較高的脫皮相關酶(谷氨酰胺合成酶、β- n -乙酰氨基葡萄糖酶和幾丁質酶)活性。145 mg/L組與對照組相比，外骨骼外表皮密度增大，鞘內增厚，上皮細胞形態(tài)呈柱狀;基于GenoLab M高通量測序平臺的轉錄組測序結果顯示，一些差異基因在溶酶體和鈣信號等通路中顯著富集。同時，145 mg/L劑量組脫皮相關基因維甲酸X受體、蛻皮激素受體、鈣調磷酸酶等基因的表達水平顯著升高。在205 mg/L濃度下，羅氏沼蝦Na+/K+?ATP酶α亞基的表達受到抑制，影響其蛻皮。綜上所述，在水中適量補充鈣可以促進羅氏沼蝦的蛻皮和外骨骼礦化。該研究為甲殼類水產養(yǎng)殖中外源補鈣提供了理論依據(jù)。
蛻皮是甲殼類海洋生物生命周期中重要的生理過程，對甲殼類海洋生物的生長發(fā)育、繁殖和肢體再生具有重要作用。這一過程的特點是一系列形態(tài)學變化，主要包括蛻皮期間(C)、蛻皮前(D)、蛻皮(E)和蛻皮后(AB)階段。甲殼類動物的外骨骼主要由碳酸鈣組成，鈣的來源是食物、水和體內儲存。然而，飼料中的鈣含量不能滿足甲殼類動物蛻皮的需要。因此，在水中添加外源鈣已成為甲殼類水產養(yǎng)殖的普遍做法。人們普遍認為，在水中適量補充外源鈣可以促進甲殼類脫殼。但目前外源鈣補充對甲殼類動物蛻皮影響的分子機制尚不清楚。
01?轉錄組揭示不同鈣濃度下肝胰臟基因表達
為了闡明不同鈣濃度下羅氏沼蝦換殼的遺傳調控機制，該研究對羅氏沼蝦肝胰腺樣本進行了RNA-seq分析。差異分析表明， 145 mg/L組大多數(shù)差異基因上調(圖1B)。145 mg/L組 VS 25 mg/L組、85 mg/L組 VS 145 mg/L組中鑒定的差異基因數(shù)量大約是85 mg/L組 VS 25 mg/L組、205 mg/L組 VS 25 mg/L組、145 mg/L組 VS 205 mg/L組比較中鑒定的差異基因數(shù)量的2倍(圖1C)。在5個比較組中，共有18、19、17、24和22個KEGG通路被顯著富集，如MAPK信號通路(ko04010)和Wnt信號通路(ko04310)。代謝途徑(ko01100)是兩兩比較中檢測到的共有通路，除145 mg/L組和205 mg/L組比較外，4組均檢測到溶酶體信號通路。有趣的是，鈣信號通路(ko04020)和溶酶體通路(ko04142)在85 mg/L組和145 mg/L組的比較中被顯著富集(圖1D)，鈣信號通路在205 mg/L組和25 mg/L組的比較中也被顯著富集。
圖1?兩兩比較羅氏沼蝦4組間差異表達基因的數(shù)量
02?轉錄組揭示外源補鈣對蝦蛻皮調控關鍵基因
為了進一步篩選出蛻皮調控的關鍵候選基因，該研究對溶酶體和鈣信號通路中的差異基因進行了篩選和聚類(圖2A)。聚類分析表明，145 mg/L組與其他組相比具有特定的基因表達模式，205 mg/L組的基因表達趨勢與對照組相似。145 mg/L組鞘磷脂磷酸二酯酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B單鈣轉運蛋白和腺嘌呤核苷酸轉位酶等基因的表達水平在中上調，而外源性類固醇調節(jié)樣蛋白的表達受到抑制。溶酶體途徑中的ERP抑制蛻皮激素的產生。此外，鞘磷脂磷酸二酯酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B等基因位于溶酶體通路的關鍵節(jié)點，其表達水平上調會調節(jié)溶酶體中的鈣通道(圖3)。
為了揭示4組的基因表達動態(tài)，使用TCseq對所有差異進行表達趨勢分析，并根據(jù)4組的基因表達趨勢選擇兩個聚類(圖3B)。聚類1顯示1461個差異基因聚集在一起，145 mg/ L組基因表達量最高。KEGG富集分析表明，差異基因在“氧化磷酸化”(ko00190)中顯著富集。隨著鈣濃度的升高，簇2整體呈上升趨勢。KEGG富集分析顯示，基因主要富集于“Rap1信號通路”(ko04015)和“FoxO信號通路”(ko04068)。
圖3?參與溶酶體和鈣信號通路的差異基因熱圖
1.?本文研究了不同鈣濃度水中羅氏沼蝦蛻皮頻率、蛻皮相關酶、外骨骼礦化和轉錄調控的變化。研究發(fā)現(xiàn)，適量的外源補鈣可以促進羅氏沼蝦的蛻皮和外骨骼礦化；
2.?RNA-seq分析表明，適當?shù)拟}濃度可抑制蛻皮抑制激素（MIH）和?fushitarazu factor 1 (ftz-f1)?的表達水平，從而介導MIH信號通路下游基因的表達，影響羅氏沼蝦的蛻皮過程；
3.?水中鈣含量過高會抑制ATPase alpha subunit (atpa)?的表達，影響羅氏沼蝦的蛻皮。這些發(fā)現(xiàn)有助于理解鈣調控羅氏沼蝦蛻皮的分子機制。
Ding, Li, et al. "Changes in molting frequency and expression patterns of molting-related genes in Macrobrachium rosenbergii with exogenous calcium supplement in water." Aquaculture 586 (2024): 740761.