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GPB | 雙色單分子測序平臺GenoCare 1600及其臨床應用
時間:
2024-06-24
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GPB | 雙色單分子測序平臺GenoCare 1600及其臨床應用



文章梗概

近日,真邁生物Genomics, Proteomics & Bioinformatics(IF11.5,Genetics?&?Heredity JCR Q1)上發(fā)表了題為A Two-color Single-molecule Sequencing Platform and Its Clinical Applications的研究成果。該研究介紹了真邁生物GenoCare 1600系列單分子基因測序平臺的雙色熒光測序化學原理,并完成了大腸桿菌標準樣品測序,下機數(shù)據(jù)一致序列的準確率達到99.99%。研究者還評估了GenoCare 1600在微生物混合物和新冠患者咽拭子樣本上的檢測性能。研究結果表明:GenoCare 1600可以完成微生物的定量,靈敏地識別新冠狀病毒,并能準確檢測病毒的突變位點(通過Sanger測序驗證),以上性能顯示了其優(yōu)秀的臨床應用潛力。


背景介紹

過去二十年,DNA測序技術已成為科研和診斷領域的關鍵工具。人類基因組計劃的完成,高通量測序技術(next-generation sequencing, NGS)取得了突飛猛進的發(fā)展,尤其是基于邊合成邊測序(sequencing-by-synthesis)的技術。與此同時,單分子測序技術(Single-molecule sequencing)也取得顯著突破,如:Pacific Biosciences采用零模波導檢測單個DNA聚合酶延伸發(fā)出熒光信號的single-molecule real-time、Oxford Nanopore Technologies的納米孔測序技術。雖然這兩種測序技術產生的reads更長(>10 Kb),但因測序通量低(單個run下機reads數(shù)少)、試劑成本高以及實驗繁瑣等因素大大限制其在臨床上的應用。


*以下為該研究成果解讀

結果概要


01??單分子雙色測序化學實驗流程與性能




經過72 cycles,雙色反應系統(tǒng)的read長度就達到約41 nt,比單色反應系統(tǒng)120 cycles的read長了2 nt,均能產出10 M reads,而且整體錯誤率比單色更低。實驗操作方面,文庫構建步驟少,時間短,DNA文庫1.5 h (圖1A),RNA文庫2.8 h (圖1B)。


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圖1 單分子測序的文庫制備通用流程


02??單菌或混合微生物測序性能




簡單基因組(phi X174 噬菌體)測序,24 h獲得了334.3 M reads,平均每條lane的數(shù)據(jù)量為20.9 M unique reads,變異系數(shù)為4.5%。模式物種大腸桿菌,全基因測序需要15 h,豐度最高的reads為70 nt,平均測序讀長53 nt(圖2A)。平均每條lane的數(shù)據(jù)量為12.2 M,僅有0.61%的mismatch,1.45%的插入錯誤,2.76%的缺失錯誤。整體測序深度為130×(圖2B),基因組覆蓋率為99.94%,一致序列準確度為99.99%。為了模擬臨床樣本的病原微生物檢測,研究者混合了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、M13噬菌體、釀酒酵母以及人源DNA,并將GenoCare 1600的測序結果與高通量測序平臺Hiseq 4000與qPCR得到的結果進行比較。結果顯示:GenoCare 1600檢測M13噬菌體含量在10-6到10-3時與理論濃度一致,優(yōu)于qPCR。


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圖2 大腸桿菌基因組樣本的單分子測序結果


03??精準檢測新冠病毒突變位點




既然,GenoCare?1600在檢測單一噬菌體、細菌以及混合的微生物樣本方面都表現(xiàn)出優(yōu)異性能,那么,該平臺能用于新冠病毒的溯源研究嗎?研究人員采集了3例新冠陽性患者和一名健康志愿者的咽拭子。對于陽性樣本,GenoCare 1600測序得到的超過5萬條reads可以比對到新冠病毒的基因組,覆蓋了整個基因組99.9%的區(qū)域。此外,檢測得到的突變位點,均經過Sanger測序方法進行了驗證,其中位于ORF8(location 28144)的T-C突變被確認為當時流行的新冠病毒株特有突變位點。


表1 新冠病毒突變位點檢測

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結論

1.?雙色測序化學提升了單分子測序的效率,相對于單色,cycle數(shù)更少,read更長;

2.?GenoCare 1600測序平臺可以快速并準確檢測病原細菌和RNA病毒;

3.?GenoCare 1600測序平臺可以準確檢測新冠病毒的突變位點;

4.?單分子測序平臺操作簡便,對于缺少NGS測序經驗的臨床機構更為友好。


參考文獻

Chen F, Liu B, Chen M, et al. A Two-color Single-molecule Sequencing Platform and Its Clinical Applications[J]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2024: qzae006.



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