近日，國家納米科學(xué)中心曹宇虹研究員團隊在Advanced Science(IF 14.3)上發(fā)表了題為“Mitigating Cellular Dysfunction Through Contaminant Reduction in Synthetic circRNA for High-Efficiency mRNA-Based Cell Reprogramming”的研究成果。合成環(huán)狀RNA(circRNA)在生物醫(yī)學(xué)研究和治療應(yīng)用中具有巨大前景，但在合成過程中引入的雜質(zhì)會激活固有免疫反應(yīng)，顯著影響其功效。研究團隊對circRNA合成過程中RNA副產(chǎn)物的免疫原性進行了全面分析，鑒定了影響circRNA功能的關(guān)鍵雜質(zhì)，并為減輕circRNA的免疫原性，開發(fā)了一種結(jié)合纖維素過濾和酶處理的逐步純化策略。這種新的純化方法不僅可以減輕免疫應(yīng)答，還可以增強circRNA的表達，顯著提高生產(chǎn)效率。該純化策略為生產(chǎn)治療級別的RNA提供了可靠方法，對再生醫(yī)學(xué)和癌癥免疫療法具有重要意義。該研究采用SURFSeq 5000平臺完成RNA測序工作。
CircRNA具有獨特的結(jié)構(gòu)特性，相比線性mRNA更穩(wěn)定，抗降解，適合應(yīng)用于癌癥免疫療法和疫苗開發(fā)等領(lǐng)域。在circRNA的合成過程中，會生成各種免疫原性副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物可以通過RNA感應(yīng)途徑觸發(fā)免疫反應(yīng)，影響circRNA的功能。當(dāng)前的純化方法，如RNase R酶消化和尺寸排阻液相色譜(SEC)，在去除結(jié)構(gòu)化或線性副產(chǎn)物方面效果不佳，導(dǎo)致免疫激活和蛋白質(zhì)表達減少。因此，亟需一種優(yōu)化的純化策略，以高效去除激活免疫反應(yīng)的副產(chǎn)物。
體外合成circRNA的副產(chǎn)物會顯著激活先天免疫通過尺寸排阻色譜(SEC)分離未純化的編碼綠色熒光蛋白的環(huán)狀RNA (circ-eGFP)，得到3種不同組分：高分子量副產(chǎn)物組分(HMW)、主組分(circRNA、nicked RNA、線性RNA前體)和內(nèi)含子片段組分。研究將不同分離組分或未純化的circRNA轉(zhuǎn)染到PMA分化的THP-1細(xì)胞中，然后進行轉(zhuǎn)錄組分析(SURFSeq 5000平臺)、RT-qPCR驗證及細(xì)胞因子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同組分都能改變基因表達，特別是HMW組分誘導(dǎo)了強烈的免疫反應(yīng)，未純化的circRNA及其組分顯著富集了與免疫反應(yīng)相關(guān)的通路，激活了多種RNA傳感器，如TLR3/7/8、PKR、OAS、MDA5和RIG-I，導(dǎo)致細(xì)胞因子(如IFNβ、TNFα和IL6)和干擾素的產(chǎn)生?；赗T-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)未純化的circ-eGFP和HMW組分誘導(dǎo)了最高水平的RNA傳感器和細(xì)胞因子表達，結(jié)果表明其具有較高的免疫原性。這些發(fā)現(xiàn)揭示了合成circRNA過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物對先天免疫系統(tǒng)的顯著激活作用，有效的純化策略就十分必要。
圖1 由I型內(nèi)含子自剪接法合成的環(huán)狀RNA副產(chǎn)物激活先天免疫
聯(lián)合純化策略獲得的環(huán)狀RNA顯示出低的免疫原性
研究人員鑒定了幾種關(guān)鍵的免疫原性副產(chǎn)物，包括位于HMW中的dsRNA、5'三磷酸內(nèi)含子、主組分中的nicked RNA和線性RNA前體。聯(lián)合微晶纖維素(MCC)純化、RNase R酶和磷酸酶法逐步純化的circ-eGFP，免疫原性與SEC和酶處理常規(guī)法得到的超純circ-eGFP相當(dāng)，都可以有效純化由I型內(nèi)含子自剪接法合成的circRNA，有效減輕免疫反應(yīng)。此外，木材衍生的多孔纖維素(WMC)也能高效去除不同長度的dsRNA，同時保持高回收率，適用于實驗室和工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，且純化后circRNA在HeLa細(xì)胞和PBMCs中表現(xiàn)出高水平的蛋白表達，表明其在保持高純度的同時，也保持了良好的功能性和低免疫原性。轉(zhuǎn)錄組分析表明，純化后和未純化的circRNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因表達與未處理對照組差異極小，進一步證實了其低免疫原性。
圖2 純化后的環(huán)狀RNA具有低的免疫原性
聯(lián)合純化策略獲得的環(huán)狀RNA顯示出高的iPSCs的重編程效率
在細(xì)胞重編程過程中，即使是微量的雜質(zhì)也可能顯著影響蛋白表達和細(xì)胞功能，因此生產(chǎn)高純度的circRNA對于高效的細(xì)胞重編程至關(guān)重要。研究人員使用來自轉(zhuǎn)錄因子OSKMLN的circRNA進行細(xì)胞重編程實驗，結(jié)果顯示，circRNA重編程的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)展現(xiàn)出與人類胚胎干細(xì)胞相似的全局基因表達模式，特別是關(guān)鍵多能性標(biāo)記物的表達，表明成功抑制了體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序并獲得了多能狀態(tài)。此外，轉(zhuǎn)錄組分析表明，circRNA重編程的iPSCs與人類胚胎干細(xì)胞在基因表達譜上高度一致，進一步驗證了其多能性。這一結(jié)果表明，高純度的circRNA能夠有效支持細(xì)胞重編程，為再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療提供了新的工具。
圖3 純化后的環(huán)狀RNA在細(xì)胞重編程上的功能驗證
本研究通過系統(tǒng)分析和優(yōu)化純化策略，成功解決了合成circRNA中的免疫原性雜質(zhì)問題，顯著提高了circRNA的純度和功能，為其在再生醫(yī)學(xué)和癌癥免疫療法中的應(yīng)用提供了新的可能性。開發(fā)的純化策略不僅提高了circRNA的生產(chǎn)效率和純度，還為其在mRNA基礎(chǔ)細(xì)胞編程中的應(yīng)用提供了可靠的方法，特別是在iPSCs重編程和T細(xì)胞工程中表現(xiàn)出色。未來的研究應(yīng)集中于進一步優(yōu)化純化過程，提高circRNA的環(huán)化效率，減少副產(chǎn)品，以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用的目標(biāo)。
Zhang Z,?Li W,?Ren X,?et al.?Mitigating Cellular Dysfunction Through Contaminant Reduction in Synthetic circRNA for High‐Efficiency mRNA‐Based Cell Reprogramming[J].?Advanced Science,?2025:?2416629.